KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐỘT BIẾN GEN LIÊN QUAN ĐẾN ĐIỀU TRỊ ĐÍCH TRONG UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ THẾ HỆ MỚI (NGS)

Đặt vấn đề: Đột biến KRAS, NRAS và BRAF là nguyên nhân gây đề kháng với thuốc điều trị nhắm đích kháng EGFR trong ung thư đại trực tràng (UTĐTT). Mục tiêu: Khảo sát đồng thời các đột biến KRAS, NRAS và BRAF bằng kỹ thuật NGS và mối liên quan giữa các đột biến và một số đặc điểm lâm sàng. Đối tượng và phương pháp: Nghiên cứu mô tả cắt ngang hồi cứu và tiến cứu trên 58 bệnh nhân UTĐTT được xét nghiệm đột biến KRAS, NRAS và BRAF bằng kỹ thuật NGS. Kết quả: Tỉ lệ đột biến KRAS, NRAS và BRAF là 39,7%, 1,7% và 8,6%. Không bệnh nhân nào mang đột biến đồng thời trên hai hoặc ba gen. Có mối liên quan có ý nghĩa thống kê giữa đột biến gen và vị trí ung thư. Không có mối liên quan giữa đột biến gen với giới, tuổi, kích thước khối u, hoặc mức độ biệt hóa của ung thư. Kết luận: Công nghệ NGS giải trình tự đồng thời nhiều gen, mở ra tiền đề cho sự phát triển của y học cá thể hóa trong chẩn đoán và điều trị UTĐTT.

Từ khóa: Ung thư đại trực tràng, KRAS, NRAS, BRAF, điều trị đích, NGS

SUMMARY

INVESTIGATION OF GENE MUTATIONS RELATED TO ANTI-EGFR TARGETED THERAPY IN COLORECTAL CANCER BY USING NEXT GENERATION SEQUENCING (NGS) TECHNIQUE

Introduction: KRAS, NRAS, and BRAF mutations cause resistance to anti-EGFR targeted therapy in colorectal cancer (CRC). Objectives: Investigating the mutations of three genes KRAS, NRAS, and BRAF simultaneously in CRC by using NGS technology and correlation between these mutations and some clinical features. Subjects and methods: A retrospective and prospective cross-sectional descriptive study on 58 CRC patients tested for KRAS, NRAS, and BRAF mutations by using the NGS technique. Results: The mutation rate of KRAS, NRAS, and BRAF was 39.7%, 1.7%, and 8.6% respectively. No patient had two or three gene mutations simultaneously. There was a statistically significant correlation between gene mutations and tumor location. There was no statistically significant correlation between gene mutations and sex, age, or tumor size, or cancer differentiation grade. Conclusions: The application of NGS technology helps to sequence multiple genes simultaneously, opening a premise for the development of personalized medicine in the diagnosis and treatment of colorectal cancer.

Keywords: Colorectal cancer, KRAS, NRAS, BRAF, targeted therapy, NGS

I. ĐẶT VẤN ĐỀ

Ung thư đại trực tràng (UTĐTT) là một trong những bệnh ung thư phổ biến nhất ở cả hai giới và là nguyên nhân gây tử vong do ung thư đứng hàng thứ hai trên thế giới.¹ Ở Việt Nam, tỷ lệ mắc chuẩn hóa theo tuổi  của bệnh UTĐTT là 14,1 trên 100.000 dân.² Năm 2020, Việt Nam có khoảng 16.400 ca mắc mới và 8.200 ca tử vong do CRC.²

Do các triệu chứng lâm sàng của UTĐTT giai đoạn đầu không rõ ràng nên thực tế hầu hết bệnh nhân được chẩn đoán ở giai đoạn muộn. Đối với UTĐTT giai đoạn muộn, liệu pháp điều trị nhắm trúng đích với nhiều ưu điểm như liều thấp và ít độc hại đã giúp cải thiện đáng kể hiệu quả điều trị. Hiện nay, thuốc điều trị ung thư nhắm trúng đích phổ biến nhất là kháng thể đơn dòng kháng EGFR. Tuy nhiên, có một tỉ lệ lớn bệnh nhân không đáp ứng với liệu pháp kháng EGFR. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng đột biến gen KRAS, NRAS và BRAF gây ra sự hoạt hóa quá mức con đường tín hiệu EGFR là một trong những cơ chế chính của việc đề kháng với các thuốc đích kháng EGFR.^3,4 Do chi phí điều trị đích cao nên cần làm xét nghiệm các đột biến KRAS, NRAS, BRAF trước khi lựa chọn phương pháp điều trị để tránh lãng phí tiền bạc và thời gian của bệnh nhân.

Ở Việt Nam, một số tác giả đã nghiên cứu về đột biến gen trong UTĐTT nhưng chỉ đề cập đến một hoặc hai trong ba gen trên. Các nghiên cứu trước đây hầu hết sử dụng các kỹ thuật PCR với độ nhạy thấp và khả năng hạn chế chỉ phát hiện một số dạng đột biến nhất định.^5,6 Ngày nay, sự phát triển của công nghệ Giải trình tự gen thế hệ mới (Next Generation Sequencing – NGS) đã mang lại một cái nhìn toàn diện trong xét nghiệm di truyền với các ưu điểm về độ nhạy, độ chính xác, thông lượng và tốc độ cao.

Vì vậy, chúng tôi thực hiện nghiên cứu này với mục tiêu: “Khảo sát đồng thời các đột biến của ba gen KRAS, NRAS và BRAF trong UTĐTT bằng công nghệ NGS và mối tương quan giữa các đột biến này với một số đặc điểm lâm sàng”.

II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu

58 bệnh nhân được chẩn đoán UTĐTT dựa trên các triệu chứng lâm sàng, cận lâm sàng và mô bệnh học tại Bệnh viện Đại học Y Hà Nội và có kết quả xét nghiệm đột biến gen KRAS, NRAS, BRAF trước khi điều trị đích từ 1/2020 đến 6/2022.

2.2. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu mô tả cắt ngang hồi cứu và tiến cứu, phương pháp lấy mẫu thuận tiện. Thời gian nghiên cứu: 8/2021 – 6/2022.

Phân tích đột biến gen được thực hiện tại Trung tâm Di truyền lâm sàng và Hệ gen (Bệnh viện Đại học Y Hà Nội) và Đại học Quân Y bằng công nghệ NGS thế hệ hai.

Kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ thứ hai

Tách chiết DNA: Tách gDNA từ mô FFPE bằng hóa chất QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN Inc., Germany) hoặc ctDNA từ huyết tương bằng hóa chất MagMAX Cell-Free DNA Isolation Kit (Applied Biosystems, USA). Kiểm tra nồng độ DNA sau tách chiết bằng máy Qubit 4 Fluorometer (Invitrogen, USA), yêu cầu nồng độ ≥ 2 ng / µL.

Chuẩn bị thư viện: Các mẫu DNA đạt nồng độ yêu cầu được tiến hành chuẩn bị thư viện DNA bằng bộ kit Ion Plus Fragment Library (Ion Torrent, Hoa Kỳ), và sau đó làm giàu thư viện trên hệ thống Ion OneTouch 2 (Ion Torrent, Hoa Kỳ).

Giải trình tự: Thư viện DNA đã làm giàu được tải vào Ion PI Chip v3 (Ion Torrent, Hoa Kỳ) và sau đó được giải trình tự tự động trên máy giải trình tự Ion Proton (Ion Torrent, Hoa Kỳ). Dữ liệu trình tự được chuyển sang và phân tích trên Ion Torrent Server (Ion Torrent, Hoa Kỳ).

2.3. Xử lý số liệu

Số liệu sau khi thu thập được nhập vào máy tính, làm sạch số liệu, quản lý và phân tích số liệu bằng phần mềm thống kê tin học SPSS 20.

2.4. Đạo đức nghiên cứu

– Nghiên cứu tuân theo các quy định của Hội đồng Đạo đức trong Nghiên cứu Y sinh Trường Đại học Y Hà Nội.

– Chúng tôi cam kết nghiên cứu trên tinh thần trung thực.

– Tất cả thông tin về bệnh nhân được giữ kín, chỉ dùng cho mục đích nghiên cứu.

Nhận xét: 50% bệnh nhân mang đột biến một trong ba gen. Tỷ lệ đột biến KRAS cao nhất, chiếm 39,7%. Không có bệnh nhân nào có đồng thời hai hoặc ba đột biến gen.

Bảng 3. Các dạng đột biến của KRAS, NRAS và BRAF

Nhận xét: KRAS có 8 loại đột biến ở các codon 12, 13, 61 và 146. Loại đột biến gen KRAS thường gặp nhất là G12D. Gen NRAS có 1 loại đột biến Q61R và gen BRAF có 1 loại đột biến V600E.

3.3. Mối liên quan giữa đột biến gen KRAS, NRAS và BRAF và một số đặc điểm lâm sàng ở bệnh nhân UTĐTT

Bảng 4. Mối liên quan giữa đột biến gen và một số đặc điểm lâm sàng

Nhận xét: p <0,05 => Có mối liên quan có ý nghĩa thống kê giữa đột biến gen và vị trí khối u. p> 0,05 => Không có mối liên quan giữa đột biến gen với giới tính, tuổi, kích thước khối u, hoặc mức độ biệt hóa của ung thư.

IV. BÀN LUẬN

4.1. Đặc điểm chung của nhóm đối tượng nghiên cứu

Giới tính và tuổi là hai trong những yếu tố nguy cơ của ung thư nói chung và ung thư đại trực tràng nói riêng. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng tỷ lệ mắc bệnh UTĐTT ở nam giới cao hơn ở nữ giới. Theo Cơ quan Nghiên cứu Ung thư Quốc tế IARC, năm 2020, số ca mắc mới UTĐTT ở nam giới là 1.065.960 ca, ở nữ giới là 965.630 ca trên toàn thế giới.¹ Nghiên cứu của chúng tôi cũng có sự phân bổ tương tự với số lượng bệnh nhân nam cao hơn khoảng 1,5 lần so với số lượng bệnh nhân nữ.

Nguy cơ ung thư đại trực tràng tăng lên khi tuổi cao. Nghiên cứu của Bùi Ánh Tuyết tại Bệnh viện K năm 2018 cho thấy, tuổi trung bình khi chẩn đoán là 54,5 tuổi, nhóm tuổi từ 50 đến 69 là phổ biến nhất, chiếm 70,8%. Độ tuổi ít gặp nhất là dưới 30 tuổi, chiếm 4,6%.⁵ Nghiên cứu của chúng tôi cũng có kết quả tương tự. Tuổi trung bình khi chẩn đoán là 58,09 ± 14,419 tuổi, nhóm bệnh nhân từ 50 tuổi trở lên chiếm 72,4%.

Trong nghiên cứu này, ung thư trực tràng chiếm tỷ lệ cao nhất, sau đó là ung thư đại tràng trái và thấp nhất là đại tràng phải. Có sự khác biệt về tỉ lệ vị trí khối u giữa các nghiên cứu trước đó. Điều này có thể là do các phương pháp lấy mẫu khác nhau của các nghiên cứu. Tuy nhiên, vị trí khối u chỉ ảnh hưởng đến các phương pháp phẫu thuật chứ không ảnh hưởng đến chỉ định điều trị trúng đích.

4.2. Các đột biến gen KRAS, NRAS và BRAF ở bệnh nhân UTĐTT

Trong ung thư đại trực tràng, KRAS là gen được nghiên cứu nhiều nhất. Tỷ lệ đột biến KRAS cũng cao nhất, chiếm 40-60%. Các đột biến ở gen BRAF và NRAS ít gặp hơn.^5–7 Nghiên cứu của chúng tôi cũng cho kết quả tương tự. Tỷ lệ đột biến KRAS là cao nhất, 39,7%, tiếp theo là BRAF (8,6%) và tỷ lệ đột biến NRAS là thấp nhất với 1,7%. Đối với bệnh nhân mang đột biến một trong ba gen thì không được chỉ định liệu pháp nhắm trúng đích kháng EGFR, cần thay thế bằng các liệu pháp khác phù hợp.

Các đột biến của các gen KRAS, NRAS và BRAF có tính loại trừ lẫn nhau. Trong nghiên cứu của chúng tôi, không có bệnh nhân nào mang đột biến ở đồng thời hai hoặc ba gen kể trên. Vì vậy, theo khuyến cáo của Bộ Y tế, việc xét nghiệm đột biến gen NRAS và BRAF được tiến hành sau khi có kết quả xét nghiệm đột biến gen KRAS.⁸ Tuy nhiên, việc này có thể mất nhiều thời gian và gây lãng phí tiền cho bệnh nhân. Trong khi đó, với sự phát triển tiên tiến của công nghệ NGS, chúng ta có thể dễ dàng khảo sát đồng thời nhiều gen đối với một số lượng lớn mẫu.

Do tỷ lệ đột biến cao nhất nên gen KRAS cũng có nhiều dạng đột biến nhất, 8 dạng đột biến chủ yếu ở codon 12 và 13. Đột biến KRAS G12D xuất hiện nhiều nhất, với tỷ lệ 13,8%. Mỗi gen NRAS và BRAF chỉ có một loại đột biến là NRAS Q61R và BRAF V600E, đây cũng là những dạng đột biến thường gặp trong các nghiên cứu khác. Theo hiểu biết của chúng tôi, cho đến nay, chưa có nghiên cứu nào báo cáo mối liên quan giữa sự tiến triển của UTĐTT và các dạng đột biến KRAS, NRAS và BRAF.

4.3. Mối liên quan giữa các đột biến gen KRAS, NRAS và BRAF với một số đặc điểm lâm sàng ở bệnh nhân UTĐTT

Sau khi kiểm định bằng các test thống kê kiểm định, chúng tôi tìm thấy thấy có mối liên quan có ý nghĩa thống kê giữa đột biến KRAS, NRAS, BRAF và vị trí khối u (p <0,05). Không có mối liên quan giữa đột biến gen với giới tính, tuổi, kích thước khối u, hoặc mức độ biệt hóa ung thư (p> 0,05). Tỷ lệ đột biến gen ở ung thư trực tràng và trực tràng trái cao hơn so với đại tràng phải. Điều này vẫn còn nhiều mâu thuẫn giữa các nghiên cứu. Lê Thái Khương và cộng sự đã báo cáo mối liên quan giữa đột biến ở các gen KRAS, NRAS, BRAF và PIK3CA với vị trí khối u và giai đoạn bệnh, nhưng đột biến gen thường gặp nhất ở ung thư đại tràng phải.⁷ Nghiên cứu của Bùi Ánh Tuyết cho thấy nguy cơ đột biến KRAS trong ung thư trực tràng cao gấp 10 lần ung thư đại tràng.⁵

V. KẾT LUẬN

Các gen KRAS, NRAS và BRAF có tỉ lệ đột biến cao ở bệnh nhân UTĐTT. Xét nghiệm đột biến gen là bắt buộc trước khi có chỉ định điều trị trúng đích. Việc ứng dụng công nghệ NGS giúp giải trình tự đồng thời nhiều gen, mở ra tiền đề cho sự phát triển của y học cá thể hóa trong chẩn đoán và điều trị UTĐTT. Tuy nhiên, do cỡ mẫu nghiên cứu còn hạn chế nên một số kết luận không có ý nghĩa thống kê. Chúng tôi đề xuất tiến hành các nghiên cứu với cỡ mẫu lớn hơn và thời gian nghiên cứu dài hơn để đánh giá hiệu quả của liệu pháp điều trị trúng đích ở bệnh nhân UTĐTT người Việt Nam.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. IARC. Globocan 2020, Colorectal Cancer. https://gco.iarc.fr/today/data/factsheets/cancers/10_8_9-Colorectum-fact-sheet.pdf
2. IARC. Globocan 2020, Viet Nam. https://gco.iarc.fr/today/data/factsheets/populations/704-viet-nam-fact-sheets.pdf
3. Berg M, Soreide K. EGFR and downstream genetic alterations in KRAS/BRAF and PI3K/AKT pathways in colorectal cancer: implications for targeted therapy. Discov Med. 2012;14(76):207-214.
4. Van Cutsem E, Köhne CH, Láng I, et al. Cetuximab plus irinotecan, fluorouracil, and leucovorin as first-line treatment for metastatic colorectal cancer: updated analysis of overall survival according to tumor KRAS and BRAF mutation status. J Clin Oncol. 2011;29(15):2011-2019. doi:10.1200/JCO.2010.33.5091
5. Bùi Ánh Tuyết. Nghiên cứu một số đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng và tình trạng đột biến gen KRAS trong ung thư đại trực tràng tại Bệnh viện K. Luận án tiến sĩ. Trường Đại học Y Hà Nội. 2018.
6. Nguyễn Kiến Dụ. Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng và đột biến gen KRAS, BRAF ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng. Luận án tiến sĩ. Trường Đại học Y Hà Nội. 2017.
7. Lê Thái Khương, Nguyễn Đại Dương, Đỗ Đức Minh, Hoàng Anh Vũ. Khảo sát đột biến các gen KRAS, NRAS, BRAF và PIK3CA trong ung thư đại trực tràng bằng kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ mới. Tạp chí Y Học TP Hồ Chí Minh. 2021;25(6):191-197.
8. Bộ Y tế. Hướng dẫn chẩn đoán và điều trị ung thư đại – trực tràng. Quyết định số 2549/QĐ-BYT. 19/04/2018.

( Nguồn: Số 518, tháng 9/2022, Tạp chí Y Học Việt Nam, trang 223-228, link full tạp chí: )